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    外泌體系列

     外泌體(Exosome)由細胞產生,是直徑介于30-150 nm的磷脂膜分泌性囊泡,廣泛存在并分布在各種體液中(如血清、血漿、唾液、尿液)和細胞培養液等。目前的主流觀點認為,外泌體的產生先是由細胞膜內陷,形成早期內小體(Early endosome),成熟晚期內小體(Late endosome)的膜向內萌發形成腔內小泡(intraluminal vesicles,ILV)并轉化為多泡體(multivesicular bodies,MVB)。在MVB與質膜融合后,ILV被釋放到細胞外形成外泌體(Exosome)。外泌體中攜帶有母細胞的多種蛋白質、脂類、DNARNA等生物活性分子,參與機體多種生理和病理過程。


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    外泌體形成過程[1]



    外泌體的發展歷程


     目前,已有越來越多的學者開始關注外泌體在腫瘤發生和發展中的作用及其機制,外泌體將在癌癥的診斷及治療等領域發揮重要作用。有關外泌體的研究,主要集中在外泌體顆粒的提取、純化和內容物分析上。



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    外泌體的作用


    1. 作為藥物的載體進行藥物靶向治療

     RNA藥物治療是一項極具潛力的治療手段,但是由于難以掌握RNA藥物遞送的穩定性和特異性,它的應用難度也隨之增加。利用外泌體進行RNA的傳遞則可以解決這個問題。例如:將加載融合RVG肽的Lamp2b蛋白的外泌體靜脈注射至小鼠體內,檢測發現其特異性的敲降了小鼠體內BACE1(阿爾茨海默病的治療靶點)的表達[2]。

    2. 作為細胞間的信號分子,用于細胞交流

     外泌體作為細胞間的信號分子,在細胞間的信息傳遞中發揮著重要作用。例如:MPC(肌源性祖細胞)分泌含有miR-206的外泌體,來抑制成纖維細胞中Rrbp1(膠原蛋白合成的主要調節劑)的產生,從而防止過多的膠原蛋白在ECM(細胞外基質)沉積,以穩定組織狀態[3]。外泌體miR-155中miRNA可以調節下游細胞對胰島素的敏感性[4]。

    3. 調節細胞內分子水平,從而調節細胞活性

     外泌體不僅可以作為細胞間信號調節的載體,也可以主動運載細胞內各種成分,進而調節細胞活性。例如:當MLKL被RIPK3磷酸化以后,磷酸化的MLKL會引起細胞的死亡,然而MLKL產生的外泌體可將磷酸化MLKL裝入囊泡,并分泌到細胞外,使細胞免受死亡[5]。

    4. 作為分子診斷的Marker,用于疾病的診斷

     相比于傳統活檢,液態活檢取樣方便、對機體損傷小。存在于體液和細胞培養液的外泌體因其特異性和相對穩定性,在作為疾病診斷的Biomaker方面具有很大的潛力。例如:前列腺癌基因3(Prostate Cancer Associated 3,PCA3)、跨膜絲氨酸蛋白酶2 (Transmembrane Serine Proteases 2,TTSPs 2)和ETS 相關基因(ETS-related gene,ERG)融合基因在PCa患者尿液外泌體中表達,尿液外泌體具有作為PCa診斷的的潛力[6]。Raimomlo等對比了腎癌患者尿液中檢測到的186個蛋白,發現其中10個蛋白的表達有明顯差異,腎癌患者顯著高表達MMP9、DKK4和CAIX,且與腫瘤進展密切相關,提示它們有望成為潛在的分子標志物,為腎癌診斷和治療提供有價值的臨床信息[7]。



    外泌體的提取方法


     目前外泌體常見的提取方法包括超速離心法、密度梯度離心、聚合物沉降法和特異性抗體捕獲等方法。

    1. 超速離心法

    優點:方法簡單,適合大劑量的樣品處理。

    缺點:操作繁瑣,費時費力,離心力可能導致外泌體結構破壞,對設備要求高。

    2. 密度梯度離心法

    優點:純度相對較高,適合大劑量的樣品處理。

    缺點:操作繁瑣,費時費力,對設備要求高。

    3. 聚合物沉降法

    優點:操作簡單,不需要超速離心機,得到的外泌體數量較多,適合大劑量的樣品處理。

    缺點:雜質含量會比較多,尤其是一些雜蛋白。    

    4. 分子排阻法

    優點:純度相對較高,且外泌體結構不易受到破壞。

    缺點:大小相近的顆粒也會被純化出來,比如乳糜微粒、低密度脂蛋白等。

    5. 超濾法

    優點:操作方便,富集效率比較高,成本較低。

    缺點:外泌體易損耗變形,導致膜堵塞,純度較低,大顆粒蛋白污染嚴重,附著于膜上的外泌體難以回收,導致提取損失。

    6. 磁珠特異性捕獲法

    優點:外泌體純度較高,并且對外泌體膜結構影響較小。

    缺點:成本較高,無法進行大劑量的提取,磁珠保存難度比較高。

     目前外泌體提取方法,普遍存在回收率低,純度低,操作繁瑣,結構不完整等問題。針對上述問題,北京全式金生物技術有限公司開發了一系列外泌體提取新產品,可從血清、血漿、細胞上清和尿液中提取外泌體,適用于下游的電鏡分析、NTA分析、納米流式(NanoFCM)分析、Western Blot、熒光定量(qPCR)等應用。

    TransExoTM Serum/Plasma Exosome Kit

    針對從血清、血漿中外泌體提取、純化的產品,所得外泌體具有高純度、高活性的優點,可以用于Western Blot、透射電鏡、qPCR等多種檢測方式。

    ●  操作簡單,無需超速離心,只需將血清/血漿與提取試劑簡單混合,即可有效分離外泌體。

    ●  增加微球純化步驟,純度高,活性高,可以用于多種檢測方式。

    ●  血漿樣品無需蛋白酶額外處理。


    粒徑檢測

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    使用 TransGen 和 Company S 產品提取外泌體,粒徑結果顯示 TransGen 產品提取的外泌體粒徑范圍和 Comapny S 產品基本一致。



    電鏡檢測

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    TransGen 產品 (+ 微球 ) 純化得到的外泌體結構完整,雜質少,電鏡背景更加清晰。


    微球純化效果

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    使用TransGen和Company S產品提取外泌體,考馬斯亮藍染色結果顯示

    TransGen產品所得到的外泌體的雜質蛋白更少,背景干擾小。


    外泌體標志性蛋白檢測

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    使用 TransGen 產品提取外泌體,WB 檢測結果顯示

    可成功檢測到外泌體的標志蛋白 CD63、CD81 和 CD9。


    外泌體活性檢測

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    文獻 (Harris et al., 2015) 顯示 MDA-MB-231 細胞對自身分泌的外泌體敏感,在加入從該細胞上清中提取出來的外泌體后,細胞遷移速度發生明顯改變。通過劃痕實驗證明在 MDA-MB-231 細胞中,加入 TransGen 產品所提取的外泌體后,細胞遷移率隨著加入外泌體的含量增加而提高,說明所分離得到的外泌體具有活性,與文獻描述一致。


    TransExoTM Cell Media Exosome Kit

     針對細胞上清中外泌體提取、純化的產品,所得的外泌體具有高純度、高活性的優點,可以用于Western Blot、透射電鏡、qPCR、粒徑等多種檢測方式。

      操作簡單,無須超速離心。

      樣本需求量少,靈敏度高。

     

    電鏡檢測

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    使用TransGen和Company Q產品提取MDA-MB-231和Hela細胞上清中外泌體,

    電鏡檢測結果顯示均可檢測到結構完整的外泌體。


    外泌體標志性蛋白檢測

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    MDA-MB-231 細胞分別進行饑餓誘導處理和無血清培養基培養,使用 TransGen 產品和 Company Q 產品提取細胞上清中的外泌體,WB 檢測結果顯示均可檢測到外泌體的標志蛋白 TSG101、CD63、CD81。



    外泌體RNA檢測

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    使用 TransGen 和 Company Q 產品成功提取外泌體后進行 total RNA 提取,反轉錄后定量檢測miRNA (miR-92a)、lncRNA (RN7SL)、mRNA (MTND4) 表達。結果顯示均可檢測到三種 RNA 表達。


    適用于多種細胞上清外泌體提取

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    TransGen 產品提取不同種類細胞上清中的外泌體,WB 檢測結果顯示均可檢測到

    外泌體的標志蛋白 TSG101。


    TransExoTM Urine Exosome Kit

     針對尿液中外泌體提取、純化的產品,所得的外泌體具有高純度、高活性的優點,可以用于Western Blot、透射電鏡、qPCR、粒徑等多種檢測方式。

      操作簡單,無須超速離心。

      樣本需求量少,靈敏度高。



    粒徑檢測

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    使用 TransGen 和 Company Q 產品提取尿液中的外泌體,粒徑檢測結果顯示

    TransGen 產品提取的外泌體粒徑范圍和 Company Q 產品基本一致。


    電鏡檢測

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    使用TransGen和Company Q產品提取尿液中的外泌體,

    電鏡檢測結果顯示均可檢測到結構完整的外泌體。


    外泌體標志性蛋白檢測

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    使用 TransGen 和 Company Q 產品提取尿液中的外泌體,WB 檢測結果顯示

    均可檢測到外泌體的標志蛋白 TSG101、CD81、CD9。


    外泌體 RNA 檢測

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    使用 TransGen 和 Company Q 產品成功提取外泌體后進行 total RNA 提取,反轉錄后定量檢測miRNA (miR-10b-5p)、lncRNA (RN7SL)、mRNA (MTND4) 表達。結果顯示均可檢測到三種 RNA 表達。


     外泌體是由細胞分泌的膜性小囊泡,攜帶著細胞來源的蛋白質、脂質、DNA和RNA等分子。這些物質作為細胞間的信號分子,用于細胞間交流。開展外泌體中RNA研究,有助于深入了解外泌體的作用。北京全式金生物技術有限公司開發了針對血清/血漿中外泌體RNA提取新產品,可提取血清/血漿中外泌體中的總RNA。

    TransExoTM Serum/Plasma Exosome Total RNA Extraction Kit

    針對血清/血漿外泌體中總RNA提取的產品,具有操作簡便、快速、提取量高的優點,提取的RNA適用于qPCR等多種檢測方式。

      操作簡單,無需超速離心。

      提取量大,純度高,適用于多種檢測。


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    用TransGen和Company S產品提取外泌體總RNA,反轉錄后定量檢測miRNA(miR-486)、mRNA(MTND4)、lncRNA(RN7SL)的表達,結果顯示TransGen產品優于Company S產品。



    外泌體相關產品推薦

    http://www.licoricesoul.com/exosomes.html


    參考文獻

    [1] Roles of Exosomes in Ocular Diseases.

    [2] Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes.

    [3] Myogenic Progenitor Cells Control Extracellular Matrix Production by Fibroblasts during Skeletal Muscle Hypertrophy.

    [4] Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity.

    [5] MLKL,the Protein that Mediates Necroptosis, Also Regulates Endosomal Trafficking and Extracellular Vesicle    Generation.

    [6] Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer.

    [7] Differential protein profiling of renal cell carcinoma urinary exosomes.


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